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表观修饰与果实成熟如何讲故事?

gene-denovo   2017-01-04

今天来解读一篇大牛的表观文章,这篇文章运用了包括BS、RNAseq、chIP以及小RNA等组学手段去论证 DNA甲基化与植物激素乙烯,以及转录因子,共同调控果实成熟的过程,发表在《Nature Biotechnology》,IF:43.13。


Single-base resolution methylomes of tomato fruit development reveal epigenome modifications associated with ripening



研究背景


番茄有900Mb的基因组,它是研究肉质果实发育的主要模型植物。肉质果实是独特的,因为它们通常在种子成熟后经历成熟过程,所述成熟过程涉及颜色、质地、糖含量、香味和风味的不可逆变化,最终变得多汁并且成为种子传播的载体。


番茄的果实成熟是由植物激素乙烯所介导的,但是其作用是受一个未知机制的限制。乙烯涉及植物生长,发育和应激反应的许多其它方面,不能诱导其种子未成熟的果实的成熟,这可能表明额外的调节机制影响果实向成熟的转变和果实响应乙烯而成熟的能力。


研究目的与方法


为了分析这种机制是否有表观修饰的参与,文章首先是对番茄果实进行了甲基转移酶抑制剂的诱导,观察DNA甲基化对果实成熟的影响。再进一步对番茄果实成熟的4个阶段以及两个成熟基因突变体进行BS测序。同时,为了深入阐述甲基化对果实成熟的调控,作者还进行了小RNA、chIP-seq以及RNAseq分析。




文章摘要


番茄的果实成熟是由植物激素乙烯所介导的,但是其作用是受一个未知的机制的限制(成熟的果实中有未成熟的种子)。


为了分析这种机制是否有表观修饰的参与,将番茄暴露在甲基转移酶抑制剂 5-azacytidine 中,去检测番茄是否提前成熟。


同时对番茄从未成熟到成熟过程中的4个阶段,进行BS测序。检测到了52,095 差异甲基化区域(1%的基因组)。


另外,果实成熟相关转录因子RIN的结合位点,通常位于许多成熟基因的启动子的去甲基化区域中,并且结合与去甲基化一致发生。


文章的结果显示,DNA甲基化在发育过程中是有变化的,并且其变化可以保证成熟的发生。作物改良策略可能受益于不仅考虑植物品系之间的DNA序列变异,而且考虑在表观基因组中编码的信息。


研究结果


1

甲基转移酶抑制剂诱导番茄早熟


在未成熟的果实中注射5-azacytidine(甲基转移酶的抑制剂),观察到在正常的种子成熟之前的处理组的果实中有早熟部分。如下图1a,最左边的番茄是发育39天,种子开始成熟,到了42天果实开始成熟的状态。而中间的番茄是果实发育17天时,注射 5-azacytidine,在发育30天的时候开始出现成熟的区域。而最右边的则为注射水的对照组。



图1


另外,从显示成熟部分的5-azacytidine处理(右侧,处理)后的果实分离的种子在萌发测定中不萌发的,说明此时种子仍未成熟如上图1b。而未经处理的发育42天的番茄果实的种子则可以(左,对照)发芽。


此外,甲基化测序证实Cnr基因5'上游区域在成熟区中是去甲基化,而在果实绿色部分中,Cnr的5'上游区域仍然是高甲基化(如上图1c)。


同时,文章发现标志成熟基因的mRNA(包括pg2a,编码果胶酶多聚半乳糖醛酸酶和psy1,其编码八氢番茄红素合酶1,水果类胡萝卜素合成中的限速酶)可以在早期成熟部分检测到。


小结:DNA胞嘧啶甲基化的抑制作用,消除了在种子成熟之前阻止果实成熟的发育限制,导致种子成熟和果实发育过程的解偶联。


2

番茄成熟过程中的BS测序


BS测序:取样为果实从未成熟到成熟的过程取了4个时间点,以及两个成熟相关基因的突变体(包含cnr和rin),及野生型的叶片组织。文章还注释番茄基因组的转座元件,并使用RNA末端测序来分别识别17,651和18,248基因的转录起始和终止位点。 

 

下图2a是5mC的密度图,图2b是番茄染色体1的拓扑结构及其对应的甲基化率及甲基化胞嘧啶的密度图。由图可见,超过60%的区域由高度甲基化的转座元件组成,其集中在近着丝粒异染色质区域。富含基因的区域位于染色体臂中,其特征在于甲基胞嘧啶密度降低和甲基化率降低。在测定的每个样品中,约一半的基因组胞嘧啶位置被甲基化,大多数为CHH甲基化。


 图2


在之前的HPLC以及一代的甲基化测序,显示番茄不同组织中甲基化水平变化不大,但是在BS测序中,有更精确的分辨率,能够检测组织和发育特异性甲基化。如下图3a,CG和CHG甲基化在叶中比在果实中高(分别为85.51%和56.15%)(73.97-79.16%和51.99-53.88%),但是CHH甲基化在果实中较高(果实:13.52-14.20%)(叶片:8.63%);然而,两个组织中的总甲基化水平相似(22.08–24.66%)。



图3


此外,总体基因组甲基化水平的变化很大程度上反映了转座子甲基化的变化(如下图3c)。


这可能表明中等大小的基因组(例如番茄的基因组)的全局表观遗传图谱主要由其转座子序列的丰度决定,我们观察到组织的DNA甲基化模式可以在整个发育中改变,例如当果实成熟时CG甲基化的下降(如上图3b)。


为了表征在果实发育期间的表观遗传变异,我们使用滑动窗口方法,以筛选四个野生型果实阶段之间的差异甲基化区(DMR),鉴定了总共52,095个DMR,占番茄基因组的1%,并且42,187(0.02%)的胞嘧啶位置被鉴定为差异甲基化胞嘧啶。然而,而番茄DMR和DMC集中在基因5'上游。因此更可能与启动子调节区相关(如下图4 abc)。


小结甲基化修饰不仅在不同组织中有差异,并且果实的不同发育时期都存在差异。同时,果实的整体甲基化水平很大程度上反映转座子甲基化的变化。


3

果实发育过程中甲基化水平下降


我们观察到,在野生型果实发育期间,基因5'端的平均甲基化水平逐渐下降,但在成熟缺陷型Cnr和RIN突变体的果实中保持高水平(如图3d)。


Cnr等位基因编码转录因子SQUAMOSA启动子结合蛋白(SBP)的功能缺失突变体,并且rin编码截短的MADS box 转录因子。


Cnr突变体阻断果实发育,其CG甲基化水平最高,与野生型叶最相似。果实和叶甲基化分布的主成分分析证实四个野生型果实甲基化群集在一起。如图3e,而非成熟突变体与野生型果实和叶组织在PCA图中分离。这些结果支持这样的推论,DNA甲基化分布不仅在组织之间变化,在相同的组织中也会有一个持续的变化。


图4


为了研究胞嘧啶甲基化在基因的5'末端中的作用,文章首先检查Cnr基因中的甲基化模式。从Cnr突变果实的BS测序数据,我们可以定位Cnr 表观等位基因的位点,Cnr转录起始位点上游2.3-2.5kb的高甲基化区域,其在野生型中不甲基化(如图4a红色箭头)。


在野生型果实中,在Cnr的5'末端在转录起始位点上游0.7kb和1.9kb处发现了两个DMR(如图4a蓝色箭头)。值得注意的是,这两个DMR在成熟期间变为去甲基化,但在Cnr和rin功能丧失突变体的果实中保持高甲基化。


在其他已知的成熟相关基因的启动子区域中也检测到在果实成熟期间被去甲基化。但在rin或Cnr突变体中不发生去甲基化的基因,包括(pg2a 和 psy1)。这些基因,如前述也响应于未成熟果实中的甲基转移酶抑制剂 5-azacytidine 而转录。因此,DMR似乎与果实发育过程中成熟基因启动子的转录激活有关。


小结番茄果实成熟过程中的甲基化水平逐渐下降,并且与成熟相关基因(cnr)的启动子的转录激活有关。


4

DMR和RIN结合在成熟相关基因的启动子


已有研究显示RIN,MADS盒转录因子,直接调节果实成熟基因,并且其结合在Cnr突变体中减弱。BS测序数据的分析显示,基因5'端附近的区域在Cnr突变体中是高度甲基化的,为了评估DMR和成熟基因启动子的激活之间的关联,文章使用RIN抗体进行染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)。 


文章发现大多数之前描述的具有成熟功能的基因具有RIN结合位点。文章确定292个候选基因作为RIN结合目标基因,包括所有先前描述为由RIN调节的成熟相关基因,值得注意的是,两个果实特异性乙烯生物合成基因(编码ACC合酶ACS2和4)由RIN调节,这解释了为什么RIN果实在成熟开始时不能产生乙烯。


RIN还通过调控很多相关基因(例如psy1,lox家族成员(编码脂氧合酶)和pg2a)调节多种表型,包括果实颜色,香味,细胞壁结构和质地活性 ,其启动子中也显示RIN结合。


文章检测了RIN结合位点附近的甲基化变化并且发现在所有分析的组织中,平均甲基化水平低于邻近区域,包括缺乏RIN蛋白的叶和未成熟果实。这一观察结果与来自人甲状腺的数据一致,即DNA-蛋白质相互作用位点通常去甲基化(如图4d、4e)。


此外,小RNA测序结果显示在这些区域中sRNA密度保持不变(如图4f)。


先前的研究和RNA-seq表明RIN靶基因在果实成熟期间上调。因此,转录与RIN结合位点的甲基化状态负相关,RIN结合位点随着果实成熟而去甲基化。


对差异甲基化的RIN结合位点相关基因进行GO富集分析。除了果实成熟中代谢物变化的基因(包括细胞壁降解,糖代谢和类胡萝卜素,类黄酮和挥发性香味剂)外,参与乙烯合成和信号传导的基因(如ACS,ACO(ACC氧化酶) 合成),高度富集。还发现编码调节果实发育和成熟的果实特异性转录因子的基因与去甲基化RIN结合位点相关。


小结RIN调控大量成熟相关基因,这些成熟相关基因的转录与RIN结合位点的甲基化状态负相关,RIN结合位点随着果实成熟而去甲基化,从而促进成熟发育。


有趣之处

在文章的研究结果和以前的研究的基础上,作者提出了控制果实成熟的三部分的调控模型,但其中相互作用机制仍不清楚,分别是成熟激素乙烯和果实特异性转录因子,以及表观修饰。并且认为,基因组甲基化状态是种子成熟之前抑制果实成熟的关键决定因素之一。


对这篇文章感兴趣的同学,可以点击“阅读原文”去下载来精读一下。嗯的,今天就酱了~




参考文献:

【1】Zhong S, Fei Z, Chen Y, et al. Single-base resolution methylomes of tomato fruit development reveal epigenome modifications associated with ripening[J]. Nature Biotechnology, 2013, 31(2): 154-159.

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( 版权归本文原作者所有,不代表本站支持作者观点,2017年01月04日。阅读原文 )
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