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如何挖掘癌症中具有miRNAs sponge功能的lncRNAs?

gene-denovo   2017-08-10

约70%的人类基因可以转录,但是只有不到2%是蛋白编码基因(PCGs),可以编码长的蛋白。LncRNA(> 200 bp)作为非编码RNA的重要成员,数量较多,部分已被报道能够调控肿瘤生物学过程,成为很有潜力的癌症治疗靶点。


在哺乳动物中,一些small ncRNAs(约22nt)能够通过相同microRNA反应元件(MRE)同时结合mRNA和lncRNA,这种竞争性吸附miRNA的现象也被称为miRNA sponges, target mimics或者ceRNA(如果都是基因组内源型)。


今天为大家解读哈佛医学院的一篇文章,研究者从已有组学数据中综合分析前列腺癌中具有海绵吸附miRNA的lncRNAs(sp-lncRNAs),并通过相关功能实验验证了sp-lncRNAs对经典抑癌基因PTEN的调控作用。



研究背景


尽管一些pseudogenes和lncRNAs被报道具有miRNA sponges功能,关于其在癌症中的广泛性,功能重要性和相关靶基因的系统研究还很少。

研究思路

通过分析前例腺癌中lncRNA和mRNA的序列特征和表达谱,构建sp-lncRNA、miRNA和PCGs的网络互作关系图。再选择调控miRNA-PTEN相关的sp-lncRNA进行功能学验证。具体如下(图1):


图1. 生物信息分析前列腺癌中lncRNA-miRNA-mRNA相互关系的流程图


  1. 下载GEO(GSE21034和GSE46691)中前例腺癌(原发和转移)的表达谱和exon芯片数据,通过Ensembl database和RNA-seq data进行lncRNA注释,得到11,271个lncRNAs,再利用CPAT软件计算编码能力,最后筛选到10,640 lncRNAs。

  2. 通过挑选保守家族和前例腺细胞系DU145表达top 50%的miRNA作为海绵吸附miRNA候选pool;再利用TargetScan软件预测候选miRNA的靶向lncRNAs和PCGs。

  3. 从已发表Vogelstein et al.数据中选择原发和转移前例腺癌显著差异表达的45个候选癌症驱动PTGs。

  4. 利用上述候选数据预测海绵吸附miRNA的lncRNAs(sp-lncRNAs)。

    首先,根据是否具有相同MRE和表达相关性,筛选lncRNA-miRNA-mRNA的gene pairs;

    其次,筛选gene pairs中至少有10个以上共享的miRNAs,以及至少8个以上唯一的共享miRNAs位点;

    最后,再考虑两个独立的clinical cohorts (MSKCC和Mayo clinic)一定的相关性(r > 0.25)的gene pairs。

  5. 选择调控抑癌基因PTEN相关的sp-lncRNAs进行功能学验证。


研究结果


1.通过综合的生物信息学分析流程,预测lncRNA-miRNA-mRNA相互关系并构建一个网络。总共包括52个sp-lncRNAs和17个PCGs的96条调控关系。圈图中每个node表示相对独立的基因,每个edge代表sp-lncRNA-PCGs间的调控关系(图2)。


图2. sp-lncRNA-PCGs间的调控关系圈图


2.部分PCGs如PTEN和MLL2具有更多的sp-lncRNAs,暗示这些基因收到海绵调控的作用更强。网络中的PCGs至少与一个预测sp-lncRNAs相关,同时sp-lncRNAs能够调控许多PCGs,预示癌症中这种组合型调控关系(combinatorial regulation)的存在(表1)。



3.作者选择sp-lncRNAs数量较多的PTEN进行功能学验证,在8个PTEN相关sp-lncRNAs中筛选sp-lncRNAs lnc-2(CTB-89H12.4, ENSG00000230551)和lnc-6 (Taurine Upregulated Gene 1 (TUG1), ENSG00000253352);其中在MSKCC和Mayo Clinic群体中Lnc-2,lnc-6的表达一直与PTEN呈正相关状态。作者还检测了另一个sp-lncRNA lnc-7,发现其与PTEN的表达在不太的全体中相关性也不同(图3)。Lnc-2,lnc-7与PTEN表达一致性符合lncRNA-miRNA-mRNA表达的特点。


图3. sp-lncRNA lnc-2, lnc-6, lnc-7在MSKCC和Mayo Clinic群体中与PTEN表达的相关性


4.作者利用siRNA分别敲低lnc-2,lnc-6和lnc-7,通过western blot和luciferase-PTEN-3’UTR reporter实验,结果显示干扰lnc-2和lnc-6后DU145中PTEN的表达量显著降低(图4)。


图4. lnc-2,lnc-6敲低后PTEN表达显著下降


5.RT-PCR和Anti-Ago2-RIP-ChIP结果显示lnc-2,lnc-6主要分布在细胞质中,而lnc-7在细胞质中的表达量较低(图5)。由于miRNA抑制作用主要发生在细胞质中,预示着lnc-2和lnc-6更容易通过吸附miRNA调控PTEN。


图5. Lnc-2,lnc-6和lnc-7在细胞中的表达分布


6.在细胞系DU145和HCT116中进行细胞增殖实验,敲低Lnc-2和lnc-6,与敲低PTEN具有相同的作用,都可以显著加快癌症细胞的增殖。


图6. DU145,HCT116细胞增殖实验


总结


  1. 通过分析癌症中lncRNA和mRNA的组学数据,作者构建了lncRNA-miRNA-mRNA的调控网络,揭示了lncRNA通过海绵吸附miRNA来调控癌症驱动基因的作用具有一定的广泛性。

  2. 作者通过多种标准来进行数据筛选,如选取原发和转移型前列腺癌显著差异的45个癌症相关基因作为候选PTGs,选取保守和表达量高的miRNA来预测靶向lncRNA和mRNA等,这些方法都有助于缩小筛选范围,精确找到与前列腺癌最相关的调控网络。

  3. 最后,作者选取了预测网络中经典的癌症抑制基因PTEN作为候选进行功能学验证,多种角度展示了lnc-2,lnc-6 miRNA依赖型调控PTEN的作用关系,以及lnc-2,lnc-6对癌症细胞增值的重要作用,为医学研究提供分子机理。


参考文献:

【1】Du, Z., et al. (2016). Integrative analyses reveal a long noncoding RNA-mediated sponge regulatory network in prostate cancer. Nature Communications 7: 10982.


( 版权归本文原作者所有,不代表本站支持作者观点,2017年08月10日。阅读原文 )
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